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    目前臨床上應(yīng)用的抗HBV治療藥物主要有兩類：干擾素和核苷（酸）類似物，前者不良反應(yīng)較大，后者存在病毒耐藥問題?？笻BV藥物最大的問題是大多數(shù)患者在長期治療后仍不能徹底清除病毒。因此，研發(fā)針對HBV不同靶位的新藥對慢性HBV感染性疾病的治療意義重大。本文就抗HBV藥物靶位的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

    全世界約有3.5億例慢性HBV感染者，其中我國有9300萬例，包括2000萬例慢性乙型肝炎患者。慢性乙型肝炎可進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌，每年全世界有近100萬人死于慢性乙型肝炎相關(guān)疾病。盡管預(yù)防性疫苗已問世多年，降低了HBV感染率，但現(xiàn)階段仍有大量的慢性HBV感染者須要進(jìn)行抗病毒治療。目前臨床應(yīng)用的抗HBV藥物主要分為干擾素和核苷（酸）類似物兩大類，前者兼具誘導(dǎo)抗病毒蛋白產(chǎn)生和免疫調(diào)節(jié)的作用，但治療成本較高，不良反應(yīng)較大；后者則通過抑制病毒多聚酶/反轉(zhuǎn)錄酶功能，能有效降低血清病毒載量，但長期用藥可導(dǎo)致耐藥突變株的出現(xiàn)，且對病毒**的原始模板共價閉合環(huán)狀DNA無直接抑制作用。兩類藥物的共同問題是HBsAg清除率低，分別大約為10%和5%,大多數(shù)患者即使經(jīng)過長期抗病毒治療也難以清除病毒，停藥后復(fù)發(fā)率較高。借鑒抗HIV和抗HCV藥物治療經(jīng)驗，要顯著提高抗HBV療效乃至根治HBV感染，需要多靶位藥物聯(lián)合治療，藥物作用靶位將針對HBV生命周期中的各個關(guān)鍵環(huán)節(jié)（包括病毒分子及其與宿主結(jié)合作用的關(guān)鍵分子）以及提高機(jī)體抗HBV免疫應(yīng)答能力。

    1. HBV感染的生命周期

    HBV經(jīng)與受體結(jié)合進(jìn)入肝細(xì)胞后脫去衣殼，病毒DNA進(jìn)入肝細(xì)胞核，在DNA聚合酶等的作用下形成共價閉合環(huán)狀DNA,轉(zhuǎn)錄成3個短的信使RNA,編碼3種表面蛋白和1個長的前基因組RNA （pgRNA），除編碼核心抗原、e抗原和反轉(zhuǎn)錄酶外，pgRNA還作為病毒反轉(zhuǎn)錄模板，反轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈DNA,進(jìn)而合成正鏈DNA,形成含有rcDNA的成熟核心顆粒。成熟核心顆粒在細(xì)胞質(zhì)中裹上包膜蛋白成為成熟病毒體釋放至肝細(xì)胞外，部分可再次入胞核補(bǔ)充共價閉合環(huán)狀DNA.

    2. 抗HBV藥物作用靶位

    2.1  針對病毒入胞 阻止病毒入胞是預(yù)防病毒感染和防止病毒感染后肝內(nèi)擴(kuò)散的一種重要手段，也是抗病毒治療的一個重要靶點。病毒進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)之前，有一個黏附過程，有報道稱HBV最初的黏附過程與肝細(xì)胞相關(guān)的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的糖側(cè)鏈存在相關(guān)性，進(jìn)一步研究顯示病毒通過包膜蛋白抗原環(huán)硫酸乙酰肝素結(jié)合位點與肝細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖靜電結(jié)合，隨著聚集病毒顆粒的增加而二者的親和力增強(qiáng)，進(jìn)而介導(dǎo)病毒入胞。Krepstakies等研究發(fā)現(xiàn)能結(jié)合硫酸乙酰肝素的人工合成抗脂多糖肽端可以抑制HIV、HSV、HBV和HCV等包膜病毒進(jìn)入相應(yīng)的宿主，耐受性好，不良反應(yīng)少。Florian等研究發(fā)現(xiàn)人乳鐵蛋白衍生肽段1-23包含GRRRR陽離子簇，可中和病毒包膜表面帶負(fù)電的氨基酸殘基而阻止HBV的黏附和侵入。有研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞膜上的鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP）是HBV和HDV的功能性受體，介導(dǎo)HBV入胞，后續(xù)進(jìn)一步研究將鼠NTCP84-87位氨基酸替換成相應(yīng)人NTCP氨基酸序列或?qū)⒈磉_(dá)人NCTP的載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)這些原來不感染HBV的動物或細(xì)胞系均能感染HBV,證實了NCTP受體在介導(dǎo)HBV入胞過程中的重要性。然而其潛在的靶向抗病毒治療藥物開發(fā)意義還有待更深入的闡明。Volz等則利用人源化小鼠證實了來自于HBV大表面蛋白，有47個氨基酸其中N端十四酰化，且具有肝細(xì)胞特異性可選擇性結(jié)合于肝細(xì)胞上HBV-preSl特異性受體的肽段Myrcludex-B不僅能有效阻止HBV在感染肝臟內(nèi)肝細(xì)胞間的擴(kuò)散，而且能抑制最初感染的肝細(xì)胞內(nèi)病毒共價閉合環(huán)狀DNA儲存庫的擴(kuò)增。因此研發(fā)病毒侵入抑制劑，使之與現(xiàn)有的抗病毒藥物聯(lián)用，有可能顯著提高療效。

    2.2  針對共價閉合環(huán)狀DNA的形成 HBV 共價閉合環(huán)狀DNA能以游離基因形式***穩(wěn)定儲存于肝細(xì)胞核內(nèi)，在HBV感染慢性化和肝炎復(fù)發(fā)中具有重要作用，因而阻止共價閉合環(huán)狀DNA形成和十分關(guān)鍵。Belloni等在細(xì)胞及動物水平上證明了干擾素 α通過表觀抑制共價閉合環(huán)狀DNA的轉(zhuǎn)錄活性而發(fā)揮其抗HBV作用。宿主抗病毒機(jī)制中活化誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase,AID）能將外源病毒DNA上胞嘧啶脫氨基生成尿嘧啶，從而使病毒**力降低，達(dá)到抑制**甚至清除病毒的目的，然而宿主體內(nèi)自生堿基切除修復(fù)系統(tǒng)中尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil-DNA glycosylase,UNG）能切除突變DNA中的尿嘧啶恢復(fù)或部分恢復(fù)病毒受損的**力。Kitamura等應(yīng)用UNG抑制劑于能表達(dá)AID的體外肝癌細(xì)胞系，使病毒共價閉合環(huán)狀DNA上大量胞嘧啶脫氨基生成尿嘧啶，導(dǎo)致病毒P區(qū)開放閱讀框產(chǎn)生大量終止密碼子，從而增強(qiáng)AID介導(dǎo)的抗病毒活性，降低胞內(nèi)RC-DNA、pre-C mRNA及胞外病毒顆粒分泌水平。Bloom等在體外HepG2.2.15細(xì)胞系和高壓水動力注射HBV表達(dá)載體小鼠模型上，證實了靶向針對HBV開放閱讀框定點區(qū)域而設(shè)計的轉(zhuǎn)錄激活劑樣效應(yīng)劑核酸酶（transc**tion activator-like effector nucleases,TALENs），可有效破壞HBV 共價閉合環(huán)狀DNA上相應(yīng)序列，降低病毒**力。Chen等進(jìn)一步研究證實TALENs與干擾素 α聯(lián)用于高壓水動力注射HBV表達(dá)載體小鼠模型上時有明顯的協(xié)同作用。Park等研究發(fā)現(xiàn)短發(fā)夾RNA （short hairpin RNA,shRNA）可通過誘導(dǎo)HBV 共價閉合環(huán)狀DNA甲基化而降低其轉(zhuǎn)錄活性，起到抗病毒作用。Cai等研究發(fā)現(xiàn)磺胺類替代物CCC-0975和CCC-0346可抑制病毒RC-DNA轉(zhuǎn)化成共價閉合環(huán)狀DNA,從而抑制共價閉合環(huán)狀DNA的形成，發(fā)揮抗病毒活性。以上研究在一定程度上證明了以共價閉合環(huán)狀DNA為靶點開發(fā)根治性藥物的可行性。

    2.3  針對前基因組包裹和核衣殼裝配 研究發(fā)現(xiàn)非核苷HBV抑制劑芳基丙烯酰胺衍生物AT-130能夠阻止前基因組RNA裝配成病毒顆粒及核衣殼的成熟，具有高度選擇性，從而有效抑制HBV在人肝癌細(xì)胞株中的**。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)耐拉米夫定病毒株和耐阿德福韋病毒株對這個化合物也同樣敏感。另一類非核苷HBV抑制劑雜芳基二氫化合物Bay 41-4109在人肝癌細(xì)胞株的體外實驗研究中被發(fā)現(xiàn)能夠干擾病毒衣殼蛋白的組裝，促進(jìn)核衣殼蛋白的解聚而發(fā)揮強(qiáng)效的抗HBV作用，且細(xì)胞毒性低。在人源化Alb-uPA/SCID小鼠模型上B rezillon等證實Bay 41-4109能有效降低模型組小鼠血清中HBV DNA載量，發(fā)揮抗病毒作用。進(jìn)而有研究表明，針對該靶位的化合物GLS4具有更強(qiáng)的抑制HBV DNA**活性。

    2.4  針對DNA合成 目前批準(zhǔn)用于治療慢性乙型肝炎患者的核苷（酸）類似物主要有5種，即拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定和替諾福韋酯，此外，恩曲他濱在有的國家也被批準(zhǔn)上市應(yīng)用。核苷（酸）類似物主要通過抑制病毒反轉(zhuǎn)錄酶而降低病毒**水平，其抗病毒效能各有差異，其中替諾福韋酯和恩替卡韋均屬強(qiáng)效、高基因屏障藥物，病毒學(xué)應(yīng)答率高，為臨床一線抗HBV用藥。但核苷（酸）類藥物不能直接作用于HBV**的原始模板共價閉合環(huán)狀DNA,難以徹底清除病毒。

    2.5  針對病毒形態(tài)發(fā)生與釋放 HBV的形態(tài)發(fā)生和釋放同樣可以作為抗病毒的新靶點。3種HBV胞膜蛋白（S,M和L蛋白）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，且有著復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，它們不僅參與病毒成熟核心顆粒的包膜化過程，還與成熟病毒的釋放有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，N-丁基脫氧野艽霉素可抑制包膜蛋白糖基化修飾過程中的葡萄糖苷酶，從而導(dǎo)致HBV包膜蛋白的錯誤折疊，進(jìn)而抑制病毒顆粒的組裝和釋放。Abdul等研究證明陽離子細(xì)胞穿透肽可以造成包膜蛋白成簇聚集，影響核心顆粒的包被，從而阻止病毒的釋放。

    2.6 針對HBx蛋白 HBx蛋白有反式激活作用，可促進(jìn)病毒自身基因表達(dá)，對HBV的**和轉(zhuǎn)錄以及HBV感染慢性化維持有重要的調(diào)控作用。因此，HBx蛋白也可作為抗病毒藥物開發(fā)的新靶點。Xie等和Li等將能表達(dá)靶向針對HBx基因的小干擾RNA （smallinterfering RNAs,siRNAs）分別轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞和注射入HBV動物模型，研究發(fā)現(xiàn)siRNA可明顯抑制HBV DNA**和表達(dá)。通過2',4'-BNA/L.NA化學(xué)修飾的siRNA,具有水溶性強(qiáng)、易入胞且對胞內(nèi)核酸酶抵抗的特點，顯著提高了抗HBV活性，延長了作用半壽期。

    3. 中草藥

    傳統(tǒng)中藥（TCMs）在治療中國乙型肝炎患者中起到了不可替代的作用，近年來也受到了世界的廣泛關(guān)注。多種中草藥及其活性成分均有強(qiáng)效的抗病毒活性。例如有研究表明漢黃芩素可抑制HBV與宿主肝細(xì)胞的細(xì)胞融合（阻斷病毒侵入與釋放），同時具有抑制HBV反轉(zhuǎn)錄酶的活性及HBsAg、HBcAg和HBeAg盼表達(dá)；氧化苦參堿可以通過下調(diào)HBV DNA**所需的熱休克蛋白70而抑制HBV**，對拉米夫定耐藥或不耐藥初治患者療效類似，聯(lián)合拉米夫定治療時有協(xié)同作用，且能降低慢性乙型肝炎患者拉米夫定耐藥突變發(fā)生率。但也有一些研究提出TCMs的抗HBV療效不確切。TCMs在標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、活性成分鑒定以及臨床隨機(jī)對照研究方面還須進(jìn)一步完善。

    4. 其他

    機(jī)體的免疫力（包括天然免疫和特異性免疫）在控制HBV感染中具有重要作用，因此，提高機(jī)體免疫力也是研發(fā)抗HBV藥物的一個策略。Lanford等在鴨肝模型上研究證實短期口服Toll樣受體-7激動劑GS-9620可通過增加干擾素 α細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)、促進(jìn)干擾素活化誘導(dǎo)基因表達(dá)和增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞對HBV感染細(xì)胞的清除能力，顯著降低血清HBV DNA和抗原水平。有研究表明慢性乙型肝炎患者由于肝臟內(nèi)缺陷的抗原遞呈系統(tǒng)使大部分T淋巴細(xì)胞處于無功能狀態(tài)，促凋亡分子BIM表達(dá)增多介導(dǎo)特異CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡，共**分子如程序性死亡分子（program death,PD）-1和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）相關(guān)抗原4（CTL-associated antigen-4,CTLA-4）表達(dá)增加，驅(qū)使T淋巴細(xì)胞功能喪失，以上證據(jù)均表明慢性乙型肝炎患者特異性免疫力處于“耗竭”狀態(tài)，白細(xì)胞介素（interleukin,11） -12可通過提供CD8+T淋巴細(xì)胞活化所需的第三信號而修復(fù)慢性乙型肝炎患者缺陷的T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性作用及分泌抗病毒相關(guān)細(xì)胞因子能力。此外，IL-21在小鼠模型上顯示出具有抗HBV活性；重組IL-7 （CYT107）聯(lián)用替諾福韋酯/恩替卡韋治療慢性乙型肝炎已獲準(zhǔn)進(jìn)行1/2a臨床試驗。提高抗HBV特異性免疫應(yīng)答的新療法主要包括治療性疫苗、樹突狀細(xì)胞疫苗、轉(zhuǎn)T細(xì)胞受體表達(dá)特異性CTL過繼免疫療法、抗PD-L1和抗CTLA-4抗體阻斷活化特異性CTL療法等，此外有研究表明用抗HBs-抗CD3雙特異性抗體，或用HBV包膜蛋白/CD3/CD28嵌合抗原受體轉(zhuǎn)基因表達(dá)可介導(dǎo)特異性殺傷，清除HBV感染肝細(xì)胞。目前已有幾種治療性疫苗進(jìn)行了治療慢性乙型肝炎的臨床試驗，但大多數(shù)針對慢性乙型肝炎的免疫制劑或療法還處于臨床前研究階段。

    5. 小結(jié)與展望

    理想的抗HBV藥物應(yīng)具備以下條件：①具有強(qiáng)效的抑制病毒**能力，耐藥發(fā)生率低；②可激發(fā)宿主自身的抗病毒免疫應(yīng)答能力；③具有良好的安全性；④作用持久，停藥無反跳；⑤可最終清除病毒。目前臨床應(yīng)用的抗HBV藥物尚不能完全滿足上述要求，因此須要研發(fā)針對不同靶位的新型強(qiáng)效抗HBV藥物，為實現(xiàn)多靶位藥物聯(lián)合抗HBV治療奠定基礎(chǔ)，為慢性HBV感染性疾病的治療提供更多手段。

    文章來源：2013北京地區(qū)肝病與感染學(xué)術(shù)年會論文集

    作者  中國人民**第302醫(yī)院   徐東平  姚偉明