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    作者：江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 周年

    正常骨組織處于一種以破骨細(xì)胞吸收骨組織和成骨細(xì)胞形成骨組織相協(xié)調(diào)的不斷重建的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。激素、脂氧化物、生長(zhǎng)因子以及炎癥細(xì)胞因子等可影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活化、分化、增殖和成熟而改變骨重建過(guò)程，打破骨吸收和骨形成間的平衡產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥。據(jù)報(bào)道到2025年，僅美國(guó)因骨質(zhì)疏松癥引起的骨折發(fā)生率就將高達(dá)每年300萬(wàn)例，因此骨質(zhì)疏松癥已成為影響人們生活質(zhì)量的流行病之一。雌激素缺乏一度被認(rèn)為是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要原因，然而補(bǔ)充雌激素骨質(zhì)疏松癥并未得到明顯改善。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)ROS可能是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要根源，其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用。因此骨質(zhì)疏松癥的治療焦點(diǎn)開始從“以雌激素為中心”轉(zhuǎn)向“以氧化應(yīng)激為中心”.

    氧化應(yīng)激的產(chǎn)生

    ROS主要是細(xì)胞線粒體在傳遞電子提供能量過(guò)程中產(chǎn)生，如超氧負(fù)離子（O2-）、羥自由基（OH-）和過(guò)氧化氫（H2O2）等。當(dāng)然，在應(yīng)對(duì)細(xì)胞外界**如生長(zhǎng)因子等時(shí)，通過(guò)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nox1）、環(huán)氧合酶及脂氧合酶等也可產(chǎn)生ROS.同時(shí)，機(jī)體還存在一套抵御ROS的防衛(wèi)系統(tǒng)，兩者間保持動(dòng)態(tài)平衡。這一系統(tǒng)包括酶及轉(zhuǎn)錄因子依賴的抗氧化酶系統(tǒng)以及細(xì)胞自身存在的自噬作用，前者主要是超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型（FoxO）轉(zhuǎn)錄引起的抗氧化酶基因等的表達(dá)。

    ROS可激活c-Jun氨基端激酶（JNK）通路使FoxO轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，并從胞漿釋入胞核，激活核上FoxO介導(dǎo)的抗氧化酶如錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、CAT基因的表達(dá)，延長(zhǎng)細(xì)胞靜息期，從而保護(hù)靜息細(xì)胞不受氧化損傷。然而過(guò)多的ROS激活FoxO轉(zhuǎn)錄還可削弱有限的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）向T細(xì)胞轉(zhuǎn)換因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）轉(zhuǎn)錄，降低成骨細(xì)胞生成。

    因此在正常情況僅依靠前者不足以**由于ROS導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)損傷，后者即為通過(guò)泛素蛋白酶體或溶酶體途徑修復(fù)或移除因細(xì)胞內(nèi)過(guò)多ROS引起的功能異常的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，以保證細(xì)胞健康的進(jìn)一步防衛(wèi)。通過(guò)其自噬作用可降解損傷的線粒體，打破損傷線粒體再次產(chǎn)生過(guò)多ROS的惡性循環(huán)，一定程度上維護(hù)骨形成和骨吸收間的平衡。機(jī)體由于衰老、疾病等原因后線粒體損傷加劇，而防衛(wèi)機(jī)制減弱，使得ROS產(chǎn)生與ROS清除間的平衡被打破，氧化應(yīng)激隨即產(chǎn)生。

    通常，在氧化應(yīng)激條件下，線粒體內(nèi)膜釋放出一種可調(diào)節(jié)蛋白p66shc,在傳遞電子過(guò)程中作為氧化還原酶將O2還原為H2O2,后者對(duì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡起到相當(dāng)關(guān)鍵的信號(hào)作用。ROS通過(guò)對(duì)多種細(xì)胞因子、酶活性的激活或抑制和上調(diào)或下調(diào)受體配體的表達(dá)調(diào)控多條信號(hào)通路，最終影響核內(nèi)基因表達(dá)，促進(jìn)BMSCs、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的凋亡和破骨細(xì)胞的增殖及分化，使得骨形成速率相對(duì)骨吸收速率滯后，導(dǎo)致骨重建平衡被打破。

    氧化應(yīng)激對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響

    氧化應(yīng)激對(duì)骨形成相關(guān)細(xì)胞的影響

    氧化應(yīng)激對(duì)BMSCs的影響：BMSCs具有多向分化的趨勢(shì)，其向成骨細(xì)胞分化同時(shí)還可向脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化。經(jīng)典Wnt/β-catenin通路在BMSCs定向分化中起到相當(dāng)重要的作用，其主要過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達(dá)，阻止BMSCs向脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化。

    研究表明：去除成人老鼠前成骨細(xì)胞β-catenin后可引起PPARγ表達(dá)增加，骨量減少及骨髓脂肪化。機(jī)體由于衰老產(chǎn)生氧化應(yīng)激后，過(guò)多的ROS不僅使得BMSCs向成骨細(xì)胞分化能力降低，同時(shí)還削弱其增殖能力，延長(zhǎng)其靜息期，導(dǎo)致成骨細(xì)胞生成減少。據(jù)報(bào)道源于老年鼠的BMSCs與年輕鼠相比，胞內(nèi)呈現(xiàn)出高水平的脂氧化物及低活力的抗氧化酶。此外，源于早年衰老綜合癥病人的BMSCs顯現(xiàn)出其分化能力的缺陷。

    ROS影響B(tài)MSCs的增殖和定向分化主要是通過(guò)氧化不飽和脂肪酸（PUFAs）激活ROS/FoxO/PPARγ/β-catenin通路而實(shí)現(xiàn)的，其使得胞內(nèi)脂氧合酶花生四烯酸15表達(dá)增加，后者氧化PUFAs產(chǎn)生脂氧化物，激活PPARγ表達(dá)并產(chǎn)生一種促氧化劑4-羥基壬烯醛繼而產(chǎn)生更多的ROS.過(guò)多的ROS通過(guò)激活FoxO轉(zhuǎn)錄和ROS作用產(chǎn)物脂氧化物通過(guò)激活PPARγ表達(dá)，兩者共同削弱Wnt/-catenin向TCF/LEF轉(zhuǎn)錄。由此可見，ROS通過(guò)氧化PUFAs激活ROS/FoxO/PPARγ/β-catenin通路削弱BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化并抑制其增殖能力，減少成骨細(xì)胞生成，從而影響骨形成作用。

    氧化應(yīng)激對(duì)成骨細(xì)胞的影響：成骨細(xì)胞由BMSCs分化而來(lái)，是骨形成的功能細(xì)胞。Wnt/β-catenin通路促進(jìn)BMSCs定向分化為成骨細(xì)胞的同時(shí)還可加快成熟成骨細(xì)胞礦化和骨基質(zhì)形成速率。穩(wěn)定表達(dá)的β-catenin進(jìn)入核內(nèi)與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)早期成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因Runx2表達(dá)，后者可調(diào)控成骨細(xì)胞的特異性基因如堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨橋蛋白及Ⅰ型膠原蛋白基因等表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟。Ⅰ型膠原蛋白引導(dǎo)局部一定濃度的磷酸鹽和鈣沉積形成羥磷灰石發(fā)生礦化形成骨基質(zhì)。ROS對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡機(jī)制主要作用于p66shc和FoxO轉(zhuǎn)錄因子。

    MariaA等人通過(guò)對(duì)UAMS-32細(xì)胞加入一種能阻斷H2O2誘導(dǎo)p66shc磷酸化的阻斷劑Ly333531處理后，發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡作用被阻斷，接著加入一種蛋白激酶C（PKC）β強(qiáng)激活劑佛波酯（PMA），發(fā)現(xiàn)可扭轉(zhuǎn)前者阻斷效應(yīng)。通過(guò)慢病毒傳導(dǎo)使用短發(fā)夾RNA使p66shc沉默后，PMA激活的凋亡效應(yīng)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）轉(zhuǎn)錄均可被阻斷。由此可推測(cè)出ROS是通過(guò)激活PKCβ誘使可調(diào)節(jié)p66shc絲氨酸（Ser36）磷酸化，并使其從胞質(zhì)進(jìn)入線粒體，放大H2O2的產(chǎn)生以及激活JNK通路誘使成骨細(xì)胞凋亡。

    此外，研究發(fā)現(xiàn)ROS也可通過(guò)磷酸化腫瘤抑制蛋白p53,使調(diào)節(jié)蛋白p66shc磷酸化，將ROS信號(hào)轉(zhuǎn)化為對(duì)成骨細(xì)胞的凋亡作用，同時(shí)p53也能直接抑制成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因Runx2和Osterix的表達(dá)。磷酸化的p66shc還可激活下游不同的效應(yīng)分子I-κB并使其磷酸化，將NF-κB釋放入核，激活成骨細(xì)胞內(nèi)的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6基因表達(dá)。TNF-α能夠抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）通路的激活抑制FoxO磷酸化，使其停留在核內(nèi)，激活FoxO轉(zhuǎn)錄表達(dá)抗氧化酶如MnSOD、CAT基因，延長(zhǎng)靜息期，對(duì)成骨細(xì)胞起到保護(hù)作用。

    然而過(guò)多的ROS通過(guò)激活FoxO轉(zhuǎn)錄還可將有限的β-catenin從TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄，降低成骨細(xì)胞的形成。綜合以上發(fā)現(xiàn)，ROS不僅通過(guò)PKCβ/p53/p66shc/JNK誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，還通過(guò)激活JNK通路及抑制Akt通路共同將Wnt/β-catenin信號(hào)通路中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄，降低成骨細(xì)胞的生成，最終減少成骨細(xì)胞數(shù)量，降低骨形成作用，引起骨質(zhì)疏松癥。

    氧化應(yīng)激對(duì)骨細(xì)胞的影響：骨細(xì)胞來(lái)源于在皮質(zhì)和網(wǎng)狀骨質(zhì)的骨重建過(guò)程中，小部分成骨細(xì)胞嵌入骨基質(zhì)中而形成。其既能接觸到骨表面，還能延伸至骨髓室，形成主要為骨陷窩小管系統(tǒng)的骨網(wǎng)絡(luò)，作為一種對(duì)機(jī)械承載力高度靈敏的傳感器來(lái)影響骨重建。

    過(guò)去認(rèn)為骨細(xì)胞僅僅是包埋在礦化骨基質(zhì)中的支撐物——即“懶惰”細(xì)胞，然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)調(diào)節(jié)破骨生成因子核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護(hù)素（OPG）來(lái)影響骨吸收和激活SOST基因表達(dá)，從而促進(jìn)硬化蛋白（Sclerostin）生成來(lái)影響骨形成，同時(shí)它通過(guò)牙基質(zhì)蛋白1和成纖維生長(zhǎng)因子23來(lái)調(diào)節(jié)骨內(nèi)磷酸鹽的平衡。

    因此，骨細(xì)胞開始作為協(xié)調(diào)骨及礦物代謝的多功能細(xì)胞，儼然已成為骨質(zhì)疏松研究中的熱點(diǎn)。骨細(xì)胞作為長(zhǎng)壽命細(xì)胞，較成骨及破骨細(xì)胞更易受到氧化應(yīng)激的影響。大量在嚙齒動(dòng)物和人體中的實(shí)驗(yàn)表明：隨著機(jī)體衰老后引起氧化應(yīng)激，骨細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少且生存能力減弱。Halloran與其同事從C57BL/6老鼠中發(fā)現(xiàn)衰老后的老鼠骨細(xì)胞數(shù)量減少且骨髓中可溶性的RANKL與Sclerostin水平降低。

    然而，盡管RANKL水平降低與衰老后網(wǎng)狀骨質(zhì)破骨細(xì)胞減少的結(jié)果一致，但Sclerostin水平降低從而促進(jìn)Wnt成骨通路激活卻與衰老后成骨細(xì)胞數(shù)量減少相矛盾。ShahnazariM等人通過(guò)對(duì)衰老老鼠骨髓中的骨代謝生化標(biāo)記物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，骨髓中的生化標(biāo)記物水平變化僅能反應(yīng)骨小梁網(wǎng)狀骨丟失情況，成骨細(xì)胞抑制因子Sclerostin水平降低可能是一種對(duì)衰老導(dǎo)致成骨細(xì)胞譜系靜息的代償反應(yīng)，其可能通過(guò)促進(jìn)造骨祖細(xì)胞增殖或分化來(lái)緩解由于衰老導(dǎo)致的成骨細(xì)胞活力降低。

    氧化應(yīng)激對(duì)破骨細(xì)胞的影響

    破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞中單核巨噬細(xì)胞系。ROS對(duì)破骨細(xì)胞的影響不同于對(duì)骨形成相關(guān)細(xì)胞的直接影響，而是通過(guò)**骨形成相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生OPG、巨噬細(xì)胞集落**因子（M-CSF）和RANKL等重要調(diào)節(jié)因子，識(shí)別破骨細(xì)胞前體細(xì)胞及破骨細(xì)胞傳導(dǎo)骨吸收信號(hào)，間接地影響破骨細(xì)胞的分化、生存和活化。M-CSF和RANKL是破骨細(xì)胞生成的兩種必需因子，它們能促進(jìn)破骨細(xì)胞分化與增殖，阻止破骨細(xì)胞凋亡并延長(zhǎng)其壽命，促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟，引起破骨細(xì)胞標(biāo)志基因如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）、降鈣素受體等的表達(dá)，最終向細(xì)胞外定向分泌HCl和溶解酶，使得骨組織脫礦、降解及溶解，形成骨陷窩。

    研究表明，RANKL/核因子κB受體活化因子（RANK）/OPG是影響破骨細(xì)胞分化、成熟的主要通路。ROS、激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等如活性維生素D3、雌激素、甲狀旁腺素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、IL-6、TNF-α等都是通過(guò)調(diào)節(jié)OPG、RANKL介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成。RANKL/RANK/OPG信號(hào)作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游部分，與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展存在密切相關(guān)性。

    氧化應(yīng)激條件下，ROS將Wnt/β-catenin信號(hào)通路中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄，抑制成骨細(xì)胞的生成和分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡的同時(shí)也下調(diào)OPG和上調(diào)RANKL的表達(dá)，使成骨細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)失偶聯(lián)。RANKL與它的同族特異性受體RANK結(jié)合，激活NF-κB、JNK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和Akt通路，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞重要的轉(zhuǎn)錄因子包括原癌基因c-fos、T細(xì)胞核因子c1等的表達(dá)，**破骨細(xì)胞前體分化，活化成熟的破骨細(xì)胞，阻止破骨細(xì)胞凋亡。同時(shí)在破骨細(xì)胞內(nèi)，RANKL可通過(guò)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6/Ras相關(guān)的C3肉毒底物1/Nox1（TRAF6/Rac1/Nox1）途徑產(chǎn)生ROS,直接參與骨基質(zhì)的降解。

    氧化應(yīng)激對(duì)骨基質(zhì)的影響

    骨組織中的細(xì)胞外基質(zhì)包括有機(jī)成分和無(wú)機(jī)成分，有機(jī)成分主要為各種膠原蛋白，無(wú)機(jī)成分為羥磷灰石結(jié)晶。異常增多的ROS和破骨細(xì)胞內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶能損傷蛋白質(zhì)的巰基和氨基，使蛋白質(zhì)變性與交聯(lián)，破壞膠原和纖維連接蛋白。破骨細(xì)胞內(nèi)分泌的TRACP能夠溶解無(wú)機(jī)成分，致使骨基質(zhì)脫礦。此外，破骨細(xì)胞通過(guò)NADPH/NADP+氧化酶系統(tǒng)直接產(chǎn)生ROS,參與骨基質(zhì)的降解。值得注意的是，許多生長(zhǎng)因子如胰島素類生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）富含于骨基質(zhì)中，其能通過(guò)磷脂酰肌醇激酶/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）途徑促進(jìn)BMSCs定向分化，然而這種促骨形成作用又是由ROS及破骨細(xì)胞的降解基質(zhì)介導(dǎo)的。

    抗氧化治療對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)后

    ROS通過(guò)激活PKCβ/p53/p66shc/JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，雌激素則通過(guò)抑制PKCβ誘導(dǎo)的p66shc磷酸化機(jī)制阻斷ROS引起的成骨細(xì)胞凋亡。因此可以推測(cè)出氧化應(yīng)激可能是隱藏于與衰老相關(guān)的骨量減少、骨脆性增加的骨質(zhì)疏松癥的主要病因。雌激素隨機(jī)體衰老減少，其抗氧化作用逐漸減弱，機(jī)體便加快了衰老對(duì)骨的作用。目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物大多從抗氧化劑著手，但大多數(shù)抗氧化劑機(jī)制僅僅局限在消除自由基的基礎(chǔ)和影響細(xì)胞信號(hào)通路的表象上，并未涉及到對(duì)作用位點(diǎn)的生物大分子的具體結(jié)構(gòu)和控制基因表達(dá)的研究上。

    總結(jié)與展望

    綜合上述發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激條件下，ROS一方面氧化PUFAs激活ROS/FoxO/PPARγ/β-catenin途徑削弱BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化及抑制其增殖，PKCβ/p53/p66shc/JNK途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，并激活JNK通路及抑制Akt通路共同將Wnt/β-catenin信號(hào)通路中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄，降低成骨細(xì)胞的骨形成作用。另一方面，上調(diào)骨形成相關(guān)細(xì)胞表面RANKL的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及成熟并直接或間接參與骨基質(zhì)的降解，最終打破骨吸收和骨形成之間的骨重建平衡，引起骨質(zhì)疏松癥。

    然而其中許多作用機(jī)制如氧化應(yīng)激對(duì)骨細(xì)胞的作用有待進(jìn)一步的深入研究。此外，骨質(zhì)疏松癥發(fā)生及發(fā)展涉及多條通路，各個(gè)通路間存在信號(hào)串話的情況，但現(xiàn)今的文獻(xiàn)沒(méi)有對(duì)其相關(guān)聯(lián)的通路有一個(gè)系統(tǒng)且清晰的概括。因此，有必要對(duì)通路中涉及到的多種受體配體、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、基因調(diào)控以及通路之間的關(guān)系進(jìn)行大量研究，便于更好的指導(dǎo)臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)。