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【PDF】蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)參考手冊(cè) - 醫(yī)學(xué)資源下載
資源作者：deyixu
資源分類：醫(yī)學(xué) - 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)
資源屬性：電子書
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上傳日期：2012-10-22 08:07:20

蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)參考手冊(cè).pdf 第一章 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 一、通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）將靶基因亞克隆到質(zhì)粒載體上 （一）PCR 引物設(shè)計(jì)的基本原則與 PCR 反應(yīng)組分和條件 1. PCR 引物設(shè)計(jì)的基本原則 （1）引物與靶基因間配對(duì)的堿基一般為 1520 。 （2）引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物 G + C 含量 宜在 4555% 左右。 （3）引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物之間尤其在 3’末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在。 （4）引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性?？捎糜?jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。 （5）引物 3’末端一般以單個(gè) C 或 G 結(jié)尾。 2. PCR 反應(yīng)組分和條件 PCR 反應(yīng)體系一般選用 50 μl 體積，其中含有： 10×Reaction buffer，5 μl 2 個(gè)引物，各 12.525 pmol (終濃度各 0.250.50 μmol/L) 4 種底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各 200μmol/L 模板 DNA，100 ng 左右 Taq DNA 聚合酶，2.53 U PCR 反應(yīng)條件一般為： （1）94℃，5 分鐘 （2）94℃變性 3060 秒 （3）5055℃ 退火 3060 秒 （4）7072℃ 延伸 3060 秒 （5）72℃ 5 10 分鐘 共進(jìn)行 2535 次循環(huán)。循環(huán)是步驟（2）和（4） (二) 質(zhì)粒 DNA 的小量制備 3 1、傳統(tǒng)方法 （1）用滅菌牙簽挑單菌落于 3 ml LB 培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。 （2）在每個(gè) EP 管中倒入 1 ml 左右的過(guò)夜培養(yǎng)物，6,000 rpm 離心 1 分鐘以收集 菌體。 （3）將菌體重懸于 100 μl 4℃預(yù)冷的溶液 I 中，并加入 200 μl 新配制的溶液 II, 蓋 緊管口，快速顛倒離心管 67 次，然后，冰浴 5 分鐘。 （4）加 150 μl 4℃預(yù)冷的溶液 III, 倒置 56 次以混合內(nèi)容物，然后，冰浴 5 分鐘。 （5）12,000 rpm 離心 10 分鐘后，小心吸取上清至另一 EP 管中。 （6）加 2 倍體積的無(wú)水乙醇，振蕩混合，并在室溫放置 5 分鐘。 （7）12,000 rpm 離心 5 分鐘后，移去上清，并用 70%乙醇漂洗 DNA 沉淀。DNA 沉淀自然干燥，并溶于 20 μl 雙蒸水或 1×TE 緩沖液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。 2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA 純化方法 離心方案（適用于產(chǎn)品 A1330， A1340，A1460 及 A1470） （1）12,000 rpm 離心 1 分鐘，以沉淀 110 ml 過(guò)夜培養(yǎng)物。 （2）用 250μl Cell Resuspension Solution 充分懸浮大腸桿菌細(xì)胞。 （3）加 250μl Cell Lysis Solution，倒置 56 次混合。 （4）加 10μl Alkaline Protease Solution，倒置 56 次混合，室溫放置 5 分鐘。 （5）加 350μl Neutralization Solution，倒置 56 次混合。 （6）室溫，最高轉(zhuǎn)速離心 10 分鐘，回收上清。 （7）將離心柱插入收集管中。 （8）將上清倒入離心柱中。 （9）室溫，最高轉(zhuǎn)速離心 1 分鐘，倒掉流穿液，將離心柱重新插入收集管中。 （10）加 750μl Wash Solution（加乙醇），最高轉(zhuǎn)速離心 1 分鐘，倒掉流穿液，將 離心柱重新插入收集管中。 （11）重復(fù)步驟（10）（用 250μl Wash Solution）。 （12）室溫，最高轉(zhuǎn)速離心 2 分鐘。 （13）將離心柱插入一個(gè)無(wú)菌的 1.5 ml 微量離心管中。 （14）在離心柱中加 50100μl NucleaseFree Water，室溫，最高轉(zhuǎn)速離心 1 分鐘。

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