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    美國密蘇里州堪薩斯城斯道爾醫(yī)學(xué)研究所Fengchao Wang博士等人建立了優(yōu)良的功能學(xué)實驗以區(qū)分小鼠及人類的腸道干細(xì)胞，并鑒定出了人和小鼠腸道干細(xì)胞可靠的表面標(biāo)志物。鑒定腸道干細(xì)胞在很大程度上依賴轉(zhuǎn)基因報告小鼠模型。但是該研究方法受到嵌合型表達的限制而且很難在人體組織中直接應(yīng)用。作者主要采用免疫組化、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)以及熒光激活流式細(xì)胞分選技術(shù)分別分析小鼠和人類腸道組織原代獲取的上皮細(xì)胞。我們在分選表達Lgr5標(biāo)記的綠色熒光蛋白細(xì)胞的基礎(chǔ)上，分析不同表面標(biāo)志物的組合。我們開發(fā)了一種培養(yǎng)流程能夠便利地從小鼠腸道分離出功能性腸道干細(xì)胞。

    并利用人腸道隱窩細(xì)胞和公認(rèn)的人腸道干細(xì)胞對該實驗方法進行了驗證。流式細(xì)胞儀篩選結(jié)果顯示小鼠表面標(biāo)志物為CD44(+)CD24(lo)CD166(+) 的小腸和結(jié)腸腸粘膜上皮細(xì)胞高表達干細(xì)胞相關(guān)基因。根據(jù)表達GRP78或c-Kit的情況排除過渡型增殖細(xì)胞及祖細(xì)胞。小鼠小腸粘膜分離出的CD44(+)CD24(lo)CD166(+) GRP78(lo/-)細(xì)胞推定為腸道干細(xì)胞，包含有Lgr5-GFP(hi)和Lgr5-GFP(med/lo) 兩個亞群。利用GSK抑制劑CHIR99021及E-鈣粘著蛋白穩(wěn)定劑Thiazovivin進行培養(yǎng)，單獨分離出的腸道干細(xì)胞中25%-30%可以形成集落。研究結(jié)果表明， CD44(+)CD24(lo)CD166(+)GRP78(lo/-)以及CD44(+)CD24(lo)CD166(+)c-Kit(-)可以簡單易行地分離純化出小鼠小腸及結(jié)腸干細(xì)胞。

    CD44(+)CD24(-/lo)CD166(+)同樣可以鑒定出人腸道干細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)為進一步研究小鼠及人腸道干細(xì)胞的功能提供了基礎(chǔ)。研究背景：因腸道上皮細(xì)胞具有結(jié)果簡單、更新速度快的特點，所以為研究成年哺乳動物干細(xì)胞的功能提供了良好的模型。小鼠體內(nèi)遺傳標(biāo)記結(jié)合世系追蹤是一種很好的鑒定小鼠腸道干細(xì)胞的方法。然而此種方法依賴轉(zhuǎn)基因或基因敲入技術(shù)將標(biāo)記蛋白例如Lgr5-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型以鑒定隱窩柱狀細(xì)胞，并通過結(jié)構(gòu)報告Bmi-1、mTert、Hopx和Lrig 1以標(biāo)記+4位置的腸道干細(xì)胞。而且，這些轉(zhuǎn)基因報告小鼠模型經(jīng)常馬賽克融合表達基因。更重要的是由小鼠中鑒定出的亞群無法直接應(yīng)用于人類相關(guān)研究。這就大大限制了在人體對腸道干細(xì)胞功能的研究。多項研究利用鑒定單一基因的表達來區(qū)分腸道干細(xì)胞，如EphB2、CD24和CD166等。

    但單一表面標(biāo)志物并不能有效地將祖細(xì)胞和分化細(xì)胞分開。例如EphB2在超過60%的人隱窩細(xì)胞中存在不同程度的表達。即使是EphB高表達的細(xì)胞群中也同時包括了腸道干細(xì)胞和Muc2+的祖細(xì)胞。表達Sox9-GFP或CD24+的分離的腸道干細(xì)胞其集落形成率僅0.2%-0.6%。由此可見，上述所有單一的細(xì)胞表面標(biāo)志物均不能很理想地分離腸道干細(xì)胞。所以鑒定能高效分離腸道干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物集合具有重要意義。然而在體外培養(yǎng)腸道干細(xì)胞存在一定的困難，其良好的生長依賴潘氏細(xì)胞的存在。雖然有報道稱Wnt3a可在體外培養(yǎng)細(xì)胞中取代潘氏細(xì)胞，但也存在爭議。有學(xué)者指出Lgr5+的隱窩柱狀細(xì)胞只有在與潘氏細(xì)胞混合而不是Wnt3a存在的情況下才可生長良好。在結(jié)腸不存在潘氏細(xì)胞的情況下c-Kit+的杯狀細(xì)胞可以支持結(jié)腸干細(xì)胞的生長但效率很低。由此可見開發(fā)出一套優(yōu)良的體外培養(yǎng)系統(tǒng)對于腸道干細(xì)胞研究十分重要。

    在本研究中，我們在Lgr5不同表達水平的基礎(chǔ)上，鑒定了小鼠腸道干細(xì)胞的表面標(biāo)志物組合，并采用新的培養(yǎng)方法研究了這類細(xì)胞的功能特性。這個方法在流式細(xì)胞儀分離鑒定的人腸道干細(xì)胞以及隱窩細(xì)胞中得到了驗證。近期發(fā)現(xiàn)腸道干細(xì)胞存在2個亞群在調(diào)節(jié)腸道組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用。一是定位于潘氏細(xì)胞區(qū)域接近+4位置的與潘氏細(xì)胞、靜止期腸道干細(xì)胞混合在一起的隱窩柱狀上皮細(xì)胞有著快速循環(huán)更新的特性。報道指出隱窩柱狀上皮細(xì)胞表達所有+4區(qū)域腸道干細(xì)胞表面標(biāo)志物。另一類是近期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)生基因消融或射線損傷時，定位在潘氏細(xì)胞區(qū)域以上的腸道干細(xì)胞儲備亞群被激活并取代損傷上皮細(xì)胞。然而遺憾的是并未鑒定出能夠區(qū)分該亞型腸道干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。