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    作者：南京醫(yī)科大學(xué) 朱彥丞

    近年來隨著骨組織工程學(xué)的迅速發(fā)展，應(yīng)用骨組織工程技術(shù)治療骨缺損為當(dāng)前發(fā)展趨勢(shì)，異位成骨動(dòng)物模型相對(duì)于原位成骨可以減少實(shí)驗(yàn)中影響成骨的變量，能評(píng)估成骨干細(xì)胞、成骨誘導(dǎo)材料的效果。異位成骨動(dòng)物模型的建立方法從最早的皮下和肌肉小袋植入模型，到后來的腎被膜植入以及腹腔內(nèi)植入模型，各有特點(diǎn)，選擇一個(gè)合適的模型對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功有著密切的關(guān)系。本文將對(duì)異位成骨動(dòng)物模型的研究進(jìn)展作一綜述。

    皮下植入模型

    皮下植入模型操作方法簡單，應(yīng)用最為廣泛。模型可選擇的動(dòng)物大到豬、犬，小到兔、大鼠、小鼠，目前應(yīng)用最廣泛的是鼠類。皮膚切口的選擇在背部，不僅植入空間大，而且鼠不容易觸碰到傷口的縫線，有利于切口愈合，若行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，可在背部對(duì)側(cè)皮下植入作為對(duì)照。

    Kasten等為比較修飾后生長分化因子5（GDF-5）與原生GDF-5及骨形態(tài)生成蛋白2（BMP-2）的成骨能力，將分別含有修飾后GDF-5、BMP-2以及原生GDF-5的磷酸三鈣材料植入24只小鼠背部皮下區(qū)域，4周后測(cè)量ALP含量比較早期成骨情況，得出修飾后GDF-5與BMP-2成骨能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均優(yōu)于原生GDF-5的結(jié)論。考慮到小型豬的骨再生率與人類接近，Metzler等選擇35只小型豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，切口選擇在豬的椎旁皮下區(qū)域，用以模擬人類骨再生模型比較富血小板血漿（PRP）對(duì)植入牛屬羥基磷灰石（bHAP）、藻類羥基磷灰石（pHAP）、生物玻璃（BG）骨替代材料成骨效果的影響，結(jié)果提示PRP對(duì)bHAP及pHAP成骨能力提高顯著，BG實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均未見有異位成骨出現(xiàn)。骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）作為一種多能干細(xì)胞是經(jīng)典的植入細(xì)胞，但單純干細(xì)胞植入效果往往不佳，尤其在皮下植入模型，所以常常聯(lián)合羥基磷灰石、磷酸三鈣、聚己內(nèi)脂等支架材料和BMP等細(xì)胞因子加以誘導(dǎo)，Noshi等將多孔羥基磷灰石材料（HA）、HA/BMP、HA/MSCs及HA/MSCs/BMP分別植入大鼠皮下，結(jié)果顯示HA和HA/BMP組未見類骨質(zhì)形成，HA/MSCs組在植入4周后可見新生骨出現(xiàn)，而HA/MSCs/BMP組則在2周后即可見明顯的新骨生成，4周后新骨形成量及范圍更大，提示三者聯(lián)合使用能夠更大程度地促進(jìn)誘導(dǎo)成骨。

    采用皮下植入模型的一個(gè)缺陷是由于皮下組織松弛，植入物有游離的可能，尤其在使用大型動(dòng)物且時(shí)間跨度長的實(shí)驗(yàn)中更容易發(fā)生。成骨產(chǎn)物與周圍組織外觀類似使產(chǎn)物更難分辨，進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記可以有效解決此類問題。解芳等采用熒光染料CM-Dil標(biāo)記BMSCs與TCP復(fù)合植入比格犬背部皮下，8周后取材行組織學(xué)檢測(cè)，HE染色后可見支架孔隙中有類骨基質(zhì)沉積，使用熒光顯微鏡可觀察到標(biāo)記細(xì)胞的存在。此外皮下植入異位成骨相比于其他部位異位成骨模型在成骨能力上較差。

    Yoshida等通過比較在20只Wistar大鼠的皮下與肌肉內(nèi)分別植入以I型膠原為載體的rhBMP-2的成骨情況，在術(shù)后1、3、7、21d測(cè)量皮下與肌肉的堿性磷酸酶及鈣含量評(píng)估初期成骨，結(jié)果顯示術(shù)后第7、21d肌肉的堿性磷酸酶與鈣含量均高于皮下，提示皮下的成骨環(huán)境要差于肌肉內(nèi)。這種差異的產(chǎn)生一般認(rèn)為是皮下的氧壓、血供即細(xì)胞生長環(huán)境不及肌肉，此外肌肉本身含有未分化成骨干細(xì)胞，在成骨環(huán)境中容易分化為成骨細(xì)胞誘導(dǎo)成骨，而皮下則缺乏此類細(xì)胞。然而，也有學(xué)者觀察到相反的結(jié)果，Gotz等將羥基磷灰石支架植入于哥廷根小豬的皮下和肌肉中，在植入10周，4、8個(gè)月后經(jīng)組織學(xué)測(cè)量顯示植入皮下的新生骨構(gòu)成比要比植入肌肉的多，提示皮下植入成骨要比肌肉明顯，但作者考慮可能是羥基磷灰石顆粒在肌肉中的生物力學(xué)作用抑制了異位成骨的形成所致。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)即使不加入干細(xì)胞，僅植入成骨誘導(dǎo)因子及支架也可以誘導(dǎo)成骨，考慮可能是由于皮膚損傷可以導(dǎo)致循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的聚集所致。

    肌袋植入模型

    肌袋植入模型應(yīng)用于犬、山羊、兔子等動(dòng)物的研究較多。體型較小動(dòng)物植入部位的選擇大多在后肢的大腿或臀部肌群處，而在犬、山羊等大型動(dòng)物，則多選擇背部，豎脊肌、斜方肌常為植入部位。Wang等為研究羥基磷灰石支架多孔結(jié)構(gòu)的成骨能力，選擇2歲齡的犬為研究對(duì)象，在背部T8——L5處作一脊柱旁平行切口，暴露肌肉并鈍性分離出數(shù)個(gè)肌袋后植入支架材料。肌袋植入成骨技術(shù)成熟，在人體也有著臨床應(yīng)用案例，Warnke等在2004年使用計(jì)算機(jī)3D打印技術(shù)模擬出患者缺損的下頜骨模型，將鈦網(wǎng)制成相匹配的支架，進(jìn)而將含有骨礦石、自體骨髓和骨形態(tài)生成蛋白-7（BMP-7）的鈦網(wǎng)支架植入患者的背闊肌，4周后進(jìn)行放射性元素锝99骨掃描和胸部CT檢查，結(jié)果均提示在植入部位有骨組織形成，7周后成功誘導(dǎo)成骨并進(jìn)行游離骨皮瓣手術(shù)修復(fù)了下頜骨缺損，術(shù)后4周患者可以進(jìn)行少量咀嚼活動(dòng)。

    Heliotis等在未使用骨髓或成骨干細(xì)胞情況下，僅將羥基磷灰石支架和BMP-7植入患者左側(cè)胸大肌內(nèi)，3.5個(gè)月后經(jīng)锝99骨掃描提示在支架區(qū)域內(nèi)可見骨生成，6個(gè)月后將獲得的成骨組織移植于患者左下頜骨進(jìn)行替代，行組織切片檢測(cè)顯示骨含量達(dá)17%.骨骼肌中存在2種成體干細(xì)胞類型：骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和肌源性干細(xì)胞，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示這2種干細(xì)胞在一定環(huán)境條件下具有分化成肌、骨和脂肪組織的能力。Lai等利用膠原載體和人類重組骨形態(tài)生成蛋白-2在未加入干細(xì)胞的情況下，成功地在大鼠骨骼肌袋中誘導(dǎo)成骨，表明肌肉內(nèi)存在干細(xì)胞，并可被誘導(dǎo)分化成骨。

    但Hao等分別將多孔磷酸鈣材料（pCPC）及多孔磷酸鈣復(fù)合山羊牙髓干細(xì)胞（SGDs-pCPC）植入山羊背部肌袋分組，在2、4、6、8周后未加入干細(xì)胞的pCPC分組中并未檢測(cè)出新生骨，而SGDs-pCPC分組第2周開始即見少量類骨組織出現(xiàn)，且隨時(shí)間增加類骨組織更多，同時(shí)可見血管樣物質(zhì)生成?？赡苁遣煌闹Ъ苤踩爰拔从谐晒羌?xì)胞因子的應(yīng)用導(dǎo)致了相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但同樣因?yàn)榧∪饨M織內(nèi)富含成骨干細(xì)胞所以在相同的誘導(dǎo)條件下能夠得到更多的成骨量，且骨骼肌內(nèi)血運(yùn)豐富，更有利于細(xì)胞的增殖，因而成骨能力強(qiáng)。Yang等在以豬和狗為實(shí)驗(yàn)對(duì)象上的研究顯示在肌肉內(nèi)異位成骨45d即可被組織學(xué)上觀察到，而皮下植入成骨則需要60d.需要注意的是有研究顯示當(dāng)肌肉損傷后，BMP信號(hào)通路會(huì)上調(diào)。在應(yīng)用肌袋植入模型時(shí)，BMP信號(hào)的上調(diào)會(huì)促成骨因素的產(chǎn)生，可能影響研究結(jié)果。因此鈍性分離肌肉，避免肌纖維的損傷可以較大程度避免該因素的干擾。

    腎被膜植入模型

    腎被膜植入模型因?yàn)槠洳僮鞯膹?fù)雜性所以在實(shí)際應(yīng)用中并不廣泛。模型一般使用鼠類，在其腎被膜處鈍性分離出一小袋狀，將植入物放入。采用袋狀放置植入物，考慮可以一定程度避免植入物的移位、游離。要注意保持腎被膜的完整性有利于確保植入物放置在位且可促進(jìn)成骨血管化。此外還有用穿刺的方法直接將細(xì)胞打入腎被膜內(nèi)，但成功率較開放植入降低。王娟等將人臍帶MSCs注射到BALB/c裸鼠腎被膜下，3個(gè)月后人臍帶MSCs仍為梭形排列，未見類骨質(zhì)，無明顯淋巴細(xì)胞浸潤，可能系植入干細(xì)胞的密度稍低所致。

    腎被膜植入模型的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于此區(qū)域血流豐富，因而植入物相比于血運(yùn)營養(yǎng)少的皮下更易成活，細(xì)胞增殖快，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間跨度也可以較短，更易形成血管化，植入體在被血管化后，才能繼而自體化，與自體組織相容。有文獻(xiàn)報(bào)道植入腎被膜區(qū)域的組織和器官有免疫隔離作用，發(fā)生免疫排斥反應(yīng)少，可以被稱為免疫赦免區(qū)，是異體成骨培養(yǎng)的良好場(chǎng)所。此外，因?yàn)槟I被膜區(qū)域幾乎沒有成骨干細(xì)胞，因而當(dāng)植入后有成骨，則幾乎可以肯定的認(rèn)為成骨產(chǎn)物是由植入物分化或增殖而來，避免了內(nèi)源性干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。當(dāng)然，腎被膜植入模型也有局限性，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物一般為鼠類，小鼠的腎被膜組織薄，容易破裂，植入物可能游離于腹腔內(nèi)，造成實(shí)驗(yàn)失敗。且若植入小鼠腎被膜中，植入物的尺寸會(huì)受到限制，目前腎被膜植入異位成骨模型大多用于牙胚組織的研究。Zhang等為研究含rhBMP-2的β-TCP支架對(duì)牙組織形成的作用，將牙胚細(xì)胞及含rhBMP-2的β-TCP支架植入大鼠的腎被膜下，與僅植入牙胚細(xì)胞和僅植入支架的大鼠進(jìn)行對(duì)照，得出了含rh-BMP-2的β-TCP支架對(duì)牙組織形成有誘導(dǎo)作用。

    腹腔內(nèi)植入模型

    腹腔內(nèi)血運(yùn)豐富，適宜細(xì)胞生長，空間廣泛成骨量大，植入操作步驟不復(fù)雜，并且將材料植入體腔內(nèi)壁層腹膜、腹腔大網(wǎng)膜等延展性可能更好、臨床適用性更強(qiáng)，因而腹腔是不錯(cuò)的異位成骨植入部位。但目前關(guān)于此方面的研究報(bào)道仍然較少，可能是腹腔內(nèi)強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)限制了其應(yīng)用。Duailibi等將牙胚細(xì)胞及支架材料植入近交系Lewis大鼠網(wǎng)膜內(nèi)模擬牙組織體內(nèi)發(fā)育過程，12周后成功得到牙齒組織。近交系可以一定程度上避免排斥反應(yīng)，但是近交系動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本高，難以滿足大樣本的實(shí)驗(yàn)研究。

    于金華等將封閉群SD幼鼠牙胚分別植入SD成年鼠的腎被膜下、腸系膜內(nèi)、腹膜外間隙、腹腔內(nèi)和口腔黏膜下進(jìn)行比較，3周后發(fā)現(xiàn)僅在腎被膜下及腸系膜內(nèi)牙胚生長分化良好，在腹膜外間隙和腹腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量淋巴細(xì)胞浸潤，他們認(rèn)為可能系因?yàn)樵撎幫N異體移植物免疫排斥反應(yīng)嚴(yán)重導(dǎo)致。而黃鵬等在狗的腹腔內(nèi)大網(wǎng)膜下植入羥基磷灰石多孔材料并未見骨細(xì)胞生長，考慮是因?yàn)榫W(wǎng)膜包裹了支架不利于組織液的進(jìn)入和血管的生成，且網(wǎng)膜可能過濾了血液中的某些成骨成分導(dǎo)致成骨誘導(dǎo)效果不理想。既往研究中，也有學(xué)者未觀察到免疫排斥反應(yīng)發(fā)生，Shin等考慮到網(wǎng)膜內(nèi)區(qū)域血液豐富，為構(gòu)建血管化骨組織，將新生鼠MSCs與靜電紡絲多孔材料支架植入大鼠網(wǎng)膜內(nèi)，4周后取植入部位組織進(jìn)行組織切片、免疫組化以及掃描式電子顯微鏡檢測(cè)，結(jié)果均提示有類骨組織貫穿整個(gè)支架。

    討論

    異位成骨模型在骨組織工程學(xué)的研究上有著十分重要的地位，目前皮下植入，肌袋植入、腎被膜下植入異位成骨模型技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，腹腔內(nèi)異位成骨模型還有待進(jìn)一步研究。未來將進(jìn)一步建立理想的異位成骨動(dòng)物模型，為新材料的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供更為可靠的依據(jù)。

    來源：中國矯形外科雜志2015年3月第23卷第6期